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TECHNICAL ARTICLES詳細介紹
來源與改造機制
形態與生長特征
功能特性
Gal-10 表達與定位:Gal-10 主要定位于細胞外基質與細胞膜表面,表達量較親本 MARC145 細胞高 12-18 倍(qPCR 與 ELISA 檢測),培養液中濃度可達 60ng/mL,通過旁分泌效應增強周圍細胞的病毒敏感性。
病毒敏感性:對 PRRSV 的感染效率達 96% 以上(流式細胞術檢測病毒 N 蛋白),感染后 20 小時即可檢測到病毒復制,48 小時病毒滴度達 10?-10? TCID??/mL,較 MARC145 細胞高 1.5-2 個數量級;對 PRRSV 的高致病性毒株(如 HP-PRRSV)敏感性突出,檢出率達 95%,顯著優于其他猴源細胞系。
交叉反應性:對豬圓環病毒 2 型(PCV2)也具有一定敏感性,可支持其低水平復制(滴度 10? TCID??/mL),為 PRRSV 與 PCV2 共感染研究提供模型。
PRRSV 入侵機制研究
病毒吸附與內吞解析:利用 MARC145/Gal-10 的 Gal-10 高表達特性,證實其通過橋接 PRRSV 包膜 GP4 蛋白與宿主細胞表面神經jie苷脂 GM1,促進病毒的網格蛋白介導的內吞作用。通過特異性抗體阻斷 Gal-10 后,病毒內吞率下降 80%,明確其為 PRRSV 入侵的關鍵調節因子。
宿主因子協同作用:該細胞系可用于篩選與 Gal-10 相互作用的宿主蛋白,已鑒定出膜聯蛋白 A2(Annexin A2)作為共受體參與病毒內化,為 PRRSV 感染的多分子調控網絡研究提供新線索。
PRRSV 疫苗研發與優化
高效疫苗株培養:因病毒復制效率高,可縮短 PRRSV 疫苗株的培養周期,較傳統 MARC145 細胞生產工藝提升 40% 產量。例如,在該細胞系中培養的 PRRSV 弱毒疫苗株,病毒滴度穩定在 10?.? TCID??/mL,免疫仔豬后產生的中和抗體效價較常規疫苗高 1 個數量級。
新型疫苗載體評估:可作為重組腺病毒載體表達 PRRSV GP5 蛋白的宿主細胞,表達量達 2.5μg/10?細胞,免疫小鼠后誘導的細胞免疫應答(IFN-γ 分泌)較 MARC145 細胞高 50%,為載體疫苗研發提供高效表達平臺。
抗病du藥物篩選與機制驗證
靶向 Gal-10 的藥物篩選:基于其特性建立高通量篩選模型,已發現天然產物沒食子酸乙酯可特異性抑制 Gal-10 的凝集素活性,使 PRRSV 感染率下降 85%,EC??=0.8μM,且對細胞毒性低(CC??>60μM),為新型抗病du藥物開發提供先導化合物。
藥物協同效應評估:可用于檢測不同作用機制藥物的協同效果,例如,沒食子酸乙酯與利ba韋林聯合使用時,對 PRRSV 的抑制率達 95%,協同指數(CI)=0.3,證實二者具有顯著協同作用。
基礎培養方案
培養基:DMEM 高糖培養基添加 10% 胎牛血清,pH 維持在 7.2-7.4,可加入 1mM 丙酮酸鈉提升細胞代謝效率。
傳代流程:當細胞融合度達 80%-90% 時,棄舊培養基,PBS 洗滌 2 次,加入細胞解離液,37℃孵育 2-3 分鐘至細胞脫落,加入含血清的培養基終止消化,按 1:4 比例接種至新培養瓶,避免細胞密度過高導致 Gal-10 表達降低。
凍存保護:取對數生長期細胞,用含 10% DMSO 的wan全培養基重懸至密度 5×10?個 /mL,程序降溫后液氮保存,復蘇后傳代 2 次,待 Gal-10 表達穩定后用于實驗。
病毒感染與檢測
PRRSV 接種:細胞以 1×10?個 / 孔接種 24 孔板,培養 24 小時至融合度 70%,用無血清培養基稀釋病毒(MOI=0.05),37℃吸附 1 小時,換含 2% 血清的維持液,48 小時后通過 qPCR 檢測病毒 RNA 或間接免疫熒光檢測 N 蛋白,計算病毒滴度。
藥物篩選操作:感染前 2 小時加入待篩藥物,感染后繼續培養 48 小時,通過 CCK-8 檢測細胞活力,同時檢測病毒產量,計算抑制率與選擇指數(SI=CC??/EC??)。
優勢:
PRRSV 敏感性突出:尤其對高致病性毒株的感染效率與復制能力顯著優于同類細胞系,適合烈性 PRRSV 研究。
功能靶向性強:通過 Gal-10 過表達可特異性解析該分子在病毒感染中的作用,實驗干擾因素少。
生產效率高:疫苗株培養周期短、產量高,符合工業化生產需求。
局限性:
物種差異影響:猴源 Gal-10 與人、豬源 Gal-10 的同源性分別為 88%、82%,部分研究結果需在豬源細胞中驗證。
病毒譜較窄:對非 PRRSV 的敏感性提升有限,應用范圍受限于特定病毒研究。
傳代依賴性:傳代超過 60 代后,Gal-10 表達量下降約 20%,需定期復蘇早期凍存細胞。
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