來源與構(gòu)建：該細胞系以 CHO-K1 或 CHO-S 細胞為親本，通過慢病毒載體介導(dǎo)將人源 FVIII 基因（含 B 結(jié)構(gòu)域缺失突變，提高表達效率）導(dǎo)入細胞基因組，經(jīng)潮霉素抗性篩選及單克隆純化獲得穩(wěn)定株。“rFVIII-11" 代表其表達的重組蛋白及克隆編號，確保蛋白表達的均一性與功能性。構(gòu)建過程中采用 CMV/EF1α 雙啟動子驅(qū)動表達，結(jié)合絕緣子元件減少基因沉默，顯著提升長期表達穩(wěn)定性。

形態(tài)與增殖：體外培養(yǎng)呈上皮樣形態(tài)，兼具貼壁與懸浮生長能力，懸浮狀態(tài)下呈單個或小聚集體（直徑＜60μm），細胞圓潤飽滿，活力達 90% 以上。在 37℃、5% CO?條件下，增殖周期約 28-36 小時，可適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)基（如 EX-CELL® CHO CD），傳代 50 次以上仍能維持穩(wěn)定生長速率，高密度培養(yǎng)（細胞密度達 6×10?個 /mL）時 rFVIII 表達量無明顯下降。

表達特征：rFVIII 主要分泌至培養(yǎng)基中，表達量達 5-8 IU/10?細胞 / 24 小時（通過凝血法測定），長期傳代（＞40 代）后活性波動＜10%。該蛋白保留天然 FVIII 的 A1-A2-B-A3-C1-C2 結(jié)構(gòu)域（部分株系含 B 結(jié)構(gòu)域缺失），能與 vWF 因子結(jié)合，在凝血反應(yīng)中可激活 FX，凝血活性達天然因子的 85% 以上，翻譯后修飾（如糖基化）接近人源天然蛋白。

優(yōu)勢：rFVIII 表達穩(wěn)定且活性高，長期傳代后功能無明顯衰減，優(yōu)于瞬時表達系統(tǒng)；兼容懸浮培養(yǎng)與生物反應(yīng)器放大，適合工業(yè)化生產(chǎn)，降低藥物成本；rFVIII 翻譯后修飾接近人源，免疫原性低，臨床應(yīng)用安全性高；遺傳背景清晰，可通過基因編輯（如敲除蛋白酶基因）進一步提升蛋白產(chǎn)量與穩(wěn)定性。

局限性：rFVIII 表達量仍受限于 CHO 細胞的翻譯后修飾能力，比活性略低于血漿來源 FVIII；培養(yǎng)過程需嚴格控制蛋白酶污染，避免 rFVIII 降解；無血清培養(yǎng)時需添加特定生長因子（如胰島素），增加培養(yǎng)基成本。

培養(yǎng)條件：常規(guī)使用無血清懸浮培養(yǎng)基，添加 400μg/mL 潮霉素維持抗性篩選，補加 L - 谷an酰胺與維生素 K（促進 γ- 羧化）。傳代時采用離心法（1000×g，5 分鐘）收集細胞，避免過度消化影響活性；懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)速控制在 120-150 rpm，減少剪切力對細胞的損傷。

質(zhì)控與凍存：定期通過凝血法檢測 rFVIII 活性，Western blot 驗證蛋白完整性；采用 PCR 法檢測支原體污染，STR 鑒定確保細胞純度。凍存時使用含 10% DMSO 的無血清凍存液，梯度降溫后保存于液氮，復(fù)蘇后傳代 2 次待活性穩(wěn)定后再用于實驗。