hTERT-LSC羔羊睪丸支持細胞永生化細胞系
hTERT-LSC羔羊睪丸支持細胞永生化細胞系作為通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）介導永生化的特異性細胞模型，在反芻動物生殖發(fā)育機制、細胞永生化調(diào)控及雄性生殖疾病研究領(lǐng)域具有里程碑式的價值。它的建立突破了原代支持細胞傳代有限的瓶頸，為長期追蹤羔羊睪丸支持細胞的分化規(guī)律、生精微環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持及永生化相關(guān)信號通路研究提供了穩(wěn)定的體外平臺，對揭示反芻動物生殖細胞與支持細胞互作機制及繁育技術(shù)創(chuàng)新意義深遠。
睪丸支持細胞的體外研究長期受限于原代細胞傳代次數(shù)少（通常不超過 15 代）、增殖能力隨傳代逐漸衰退等問題，難以開展長期實驗及穩(wěn)定的功能驗證。hTERT 作為調(diào)控端粒長度的關(guān)鍵因子，通過導入該基因可使細胞突破增殖極限，實現(xiàn)永生化同時保留原有生物學特性。羔羊階段的支持細胞處于增殖分化關(guān)鍵期，其永生化細胞系的建立不僅解決了材料獲取的局限性，更能精準模擬青春期前睪丸支持細胞的生理狀態(tài)，為解析反芻動物生殖系統(tǒng)發(fā)育的時間依賴性規(guī)律提供了獨te工具。
hTERT-LSC 細胞系的建立采用嚴謹?shù)幕蚓庉嬇c細胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的方案。從健康新生羔羊睪丸組織中分離原代支持細胞，通過免疫磁珠分選（利用 CD90 特異性標志物）獲得高純度細胞群。采用慢病毒載體將 hTERT 基因?qū)朐毎?，?jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達株。陽性克隆接種于含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)液中，在 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 24 小時換液一次。待細胞匯合度達 80% 時進行傳代，目前已連續(xù)傳代超過 100 代，細胞活力仍保持在 90% 以上，顯著優(yōu)于原代細胞（傳代 15 代后活力降至 50% 以下）。
該細胞系保留典型的不規(guī)則星形形態(tài)，胞體伸展呈多角狀，胞質(zhì)突起豐富且相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細胞核呈圓形居中，核仁清晰可見。與原代 LSC 細胞相比，永生化細胞體積略大，增殖速率提高約 30%，群體倍增時間縮短至 60 小時。核型分析顯示，傳代 100 代后仍保持羔羊正常染色體數(shù)目，hTERT 基因穩(wěn)定整合于基因組中，端粒長度維持在 5-8kb（原代細胞傳代 15 代后端?？s短至 2kb 以下）。免疫熒光檢測證實，細胞高表達波形蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等支持細胞特異性標志物，且表達水平與原代細胞無顯著差異，表明永生化過程未改變其細胞屬性。
在功能特性方面，hTERT-LSC 細胞系展現(xiàn)出更穩(wěn)定的生殖支持功能。ELISA 檢測顯示，其分泌的雄激素結(jié)合蛋白（ABP）濃度穩(wěn)定在 28ng/mL，顯著高于傳代后期的原代細胞（12ng/mL），且連續(xù)傳代 50 代后分泌能力無明顯下降。與精原細胞共培養(yǎng)實驗表明，該細胞系可使精原細胞存活率提高 45%，促進其向初級精母細胞分化的比例達 30%，效果優(yōu)于原代細胞且重復性更高。在永生化機制研究中發(fā)現(xiàn)，細胞中 PI3K/Akt 信號通路持續(xù)激活，p53 抑癌基因表達受到適度抑制，為解析支持細胞永生化的分子網(wǎng)絡(luò)提供了直接證據(jù)。此外，該細胞系對生殖系統(tǒng)病原體如布魯氏菌的敏感性與原代細胞一致，感染后 24 小時即可觀察到典型的細胞病變，適合用于長期感染模型的建立。
hTERT-LSC 細胞系在多個研究領(lǐng)域展現(xiàn)出獨te優(yōu)勢。在生殖發(fā)育研究中，通過連續(xù)傳代觀察，首ci揭示了羔羊支持細胞在體外長期培養(yǎng)中類固醇合成酶的動態(tài)表達規(guī)律；在永生化機制研究中，利用該細胞系驗證了端粒酶與端粒結(jié)合蛋白 TRF2 的協(xié)同調(diào)控作用；在應用層面，已成功用于綿羊病毒性睪丸炎的藥物篩選，篩選出 3 種具有顯著保護效果的化合物。該細胞系的建立還為其他反芻動物支持細胞的永生化提供了標準化方案，目前已據(jù)此建立了牛、山羊的同源永生化細胞系。
作為首ge穩(wěn)定傳代超過 100 代的羔羊睪丸支持細胞模型，hTERT-LSC 不僅解決了原代細胞研究的局限性，更開創(chuàng)了反芻動物生殖細胞長期體外模擬的新范式。其在保持細胞原有功能特性的同時實現(xiàn)永生化的特點，為生殖生物學基礎(chǔ)研究、動物繁育技術(shù)創(chuàng)新及男性生殖疾病模型建立提供了跨物種的研究工具，對推動畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人類生殖健康研究具有重要的雙向意義。
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