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TECHNICAL ARTICLES詳細介紹
來源與建立背景
形態與生長特征
功能特性
受體表達優勢:高表達 PRRSV 關鍵受體 CD163(陽性率 98%)和唾液酸黏附素(CD169,陽性率 95%),其 CD163 表達量是 Vero 細胞的 5 倍,且與豬源 CD163 的氨基酸序列同源性達 89%,為 PRRSV 刺突蛋白提供高效結合位點;同時表達病毒入侵輔助分子硫酸乙酰肝素,可促進病毒吸附效率提升 3 倍。
病毒敏感性譜:對 PRRSV 的感染效率達 99%,24 小時出現典型細胞病變(圓縮、聚集成團),48 小時病毒滴度達 10?-10? TCID??/mL(顯著高于原代豬肺泡巨噬細胞的 10? TCID??/mL);對其他動脈炎病毒科病毒(如馬動脈炎病毒)也具有一定敏感性,但支持能力低于 PRRSV,體現病毒特異性。
功能穩定性:連續傳代 50 次后,CD163 表達量僅下降 10%,PRRSV 增殖效率保持在 95% 以上,遠高于其他傳代細胞系的表型漂移率,實驗數據重復性達 98%,為疫苗生產與藥物篩選提供可靠保障。
PRRSV 研究與疫苗開發
病毒分離與培養:作為全球 PRRSV 分離的 “金標準" 細胞系,Marc145 可從豬血清、肺組織等樣本中高效分離病毒,分離率達 90%(原代巨噬細胞僅 65%),且能保持病毒的原始毒力與抗原性,為毒株分型、變異監測提供關鍵材料。高致病性 PRRSV 毒株的首ci分離即依賴該細胞系。
疫苗生產與效力評價:在 PRRSV 滅活疫苗研發中,Marc145 細胞的病毒產量達 10?.? PFU/mL,較原代細胞提升 20 倍,疫苗免疫豬群后中和抗體陽轉率超 90%,且生產成本降低 60%,全球 80% 以上的 PRRSV 疫苗采用該細胞系生產。
抗病du藥物與診斷試劑研發
藥物篩選模型:基于其高效病毒復制能力,建立高通量抗 PRRSV 藥物篩選體系,日均可檢測 200 種化合物。通過該模型發現的核苷類似物可使病毒滴度下降 1000 倍,且對細胞毒性低(CC??/EC??>40),動物實驗顯示其能降低感染豬的病毒載量 90%,為臨床用藥提供候選分子。
診斷試劑生產:利用其高表達 PRRSV 抗原的特性,制備病毒抗體檢測試劑盒,如 CD163 蛋白 ELISA 試劑靈敏度達 92%,特異性 96%,較傳統方法檢測速度提升 3 倍,被廣泛用于豬群 PRRSV 感染狀況監測。
病毒入侵機制解析
受體結合研究:利用其 CD163 高表達特性,解析 PRRSV 刺突蛋白與受體的結合機制,通過冷凍電鏡技術發現,病毒 GP5-M 蛋白復合體與 CD163 的結合位點為第 563 位氨基酸,為受體阻斷劑設計提供分子依據。
抗病毒靶點驗證:通過 CRISPR-Cas9 敲除 CD163 基因后,PRRSV 感染率下降至 1%,證實 CD163 是病毒入侵的關鍵受體;同時發現干擾 CD169 表達可使病毒吸附效率下降 70%,為聯合抗病毒策略提供新靶點。
基礎培養方案
培養基:DMEM 高糖培養基添加 10% 胎牛血清、1% 青mei素 - 鏈mei素,pH 維持在 7.2-7.4;為提升病毒產量,可添加 2ng/mL 表皮生長因子(EGF),使 CD163 表達量提升 20%。大規模生產可采用無血清培養基,病毒產量與含血清體系相當。
傳代流程:當細胞融合度達 80% 時,消化處理后按 1:5 比例接種,離心速度 1000rpm,24 小時貼壁率超 95%,避免過度融合(>90% 會導致病毒敏感性下降)。
凍存保護:采用含 10% DMSO 的wan全培養基,細胞密度 2×10?個 /mL,程序降溫至 - 80℃過夜后轉入液氮,復蘇時 37℃水浴 1 分鐘,直接接種無需離心,存活率可達 90%,建議每 10 代更換一次細胞種子以保持活性。
病毒培養與檢測操作
PRRSV 培養優化:細胞以 2×10?個 / 孔接種 24 孔板,培養 24 小時后換含 2% 血清的維持液,加入病毒液(MOI=0.01),37℃吸附 1 小時后換液,48 小時后收集上清測滴度,TCID??法結果變異系數<5%。
中和抗體檢測步驟:將倍比稀釋的豬血清與病毒液(100 TCID??)37℃孵育 1 小時,加入 Marc145 細胞(2×10?個 / 孔),培養 72 小時觀察 CPE,以wan全抑制 CPE 的最高血清稀釋度為中和效價,結果與豬體攻毒試驗一致性達 95%。
優勢:
PRRSV 特異性優勢:CD163 高表達使其成為 PRRSV 研究的專屬模型,感染效率與數據可靠性居同類細胞系shou位,被 OIE 列為shou選細胞系。
產業化價值高:適應大規模懸浮培養,已建立標準化生產工藝,單批次病毒產量可滿足 10 萬頭份疫苗需求,成本僅為原代細胞的 1/5。
功能穩定性:連續傳代后仍保持病毒敏感性與受體表達特征,實驗重復性達 90%,適合長期機制研究與工業化生產。
局限性:
病毒譜較窄:對非動脈炎病毒科病毒的支持能力有限,如對豬瘟病毒、口蹄疫病毒的敏感性低,不適合廣譜動物病毒研究。
物種差異:源自猴而非豬,PRRSV 在細胞內的復制路徑與豬源細胞存在細微差異,研究結果需在原代豬巨噬細胞中驗證。
培養條件敏感:對血清批次差異敏感,更換血清需進行病毒產量驗證,否則易導致疫苗生產批次差異。
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